Estudio CRISPR de todo el genoma revela nuevos reguladores inmunitarios

La edición del genoma CRISPR se ha convertido en una poderosa herramienta para estudiar la función de los genes y, en los últimos años, el sistema CRISPR-Cas9 se ha adaptado para generar dos nuevas tecnologías de modulación de la expresión génica: la  activación de CRISPR (CRISPRa) y la interferencia de CRISPR (CRISPRi).

Se ha demostrado que las pantallas CRISPRa y CRISPRi son herramientas poderosas dentro de las líneas celulares inmortalizadas, pero implementarlas a escala en tipos de células primarias ha resultado ser un desafío, hasta ahora.

Investigadores de Gladstone Institutes y UC San Francisco (UCSF) han adaptado estos sistemas para que puedan implementarse con éxito en células T humanas primarias. Su estudio es el primero en utilizar CRISPRa/i a una escala tan grande en células primarias.

El objetivo de su trabajo fue mapear las vías que regulan las respuestas de las citoquinas en las células T, ya que estas a menudo se interrumpen en la autoinmunidad, las deficiencias inmunitarias y el cáncer.

«Al trabajar con células inmunitarias primarias, podemos traducir directamente las lecciones aprendidas de estos experimentos de genómica funcional directamente en terapias celulares utilizando células T modificadas con CRISPR», explicó el Dr. Zachary Steinhart, becario postdoctoral en el Instituto de Inmunología Genómica Gladstone-UCSF. y co-primer autor del estudio.

Enfoque de detección complementaria

En la primera etapa de su estudio, los investigadores optimizaron los métodos lentivirales para permitir la entrega eficiente y escalable de la maquinaria CRISPRa en las células T humanas primarias. Luego realizaron pantallas CRISPRa de todo el genoma agrupadas dirigidas a más de 18,000 genes que codifican proteínas con más de 112,000 ARN de guía única (sgRNA).

La pantalla CRISPRa identificó cientos de aciertos, incluidos algunos reguladores bien establecidos de la producción de citoquinas.

A continuación, realizaron pantallas recíprocas de pérdida de función en todo el genoma con CRISPRi, lo que les permitiría comparar qué reguladores se pueden activar o desactivar y perturbar la producción de citoquinas. En particular, la pantalla CRISPRi detectó coincidencias con funciones regulatorias críticas, incluidas algunas que CRISPRa no detectó. La pantalla CRISPRa también identificó coincidencias que no fueron detectadas por CRISPRi.

En la etapa final de su experimento, los investigadores desarrollaron una plataforma para perturbaciones CRISPRa combinadas con lectura de secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) (CRISPRa Perturb-seq) en células T humanas primarias. “Esta parte del estudio nos permitió realizar un fenotipo profundo y ver realmente qué están haciendo estos genes”, dijo el Dr. Steinhart. “Por ejemplo, podríamos explorar si estos genes cambian las células hacia estados terapéuticamente relevantes en los que luego podemos centrarnos en estudios posteriores”.

En general, el estudio permitió un mapeo funcional integral de las redes de genes que pueden modular la producción de citoquinas.

Implicaciones futuras

Los investigadores creen que su trabajo sienta las bases para futuros enfoques de detección en células T humanas primarias y, potencialmente, en otros tipos de células primarias. Además, creen que su marco de detección podría adaptarse a otras aplicaciones de edición no hereditarias de las herramientas de edición del genoma CRISPR, ampliando las oportunidades para investigar cuestiones biológicas complejas en células primarias.

Para descubrir más sobre su trabajo, lea nuestro documento técnico que profundiza en su estudio y analiza cómo su trabajo podría ayudar a guiar los esfuerzos para diseñar la próxima generación de inmunoterapias.

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