Superación de los desafíos en la detección y cuantificación de proteínas de células huésped CHO

Más de dos tercios de los productos biofarmacéuticos recombinantes, incluido más del 85 % de los fármacos de anticuerpos monoclonales, se fabrican utilizando líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO). Las impurezas residuales de la proteína de la célula huésped (HCP) derivadas de estas células pueden comprometer la estabilidad, la eficacia y la seguridad del producto terapéutico.

Por lo tanto, las autoridades reguladoras como la FDA exigen que los fabricantes controlen y demuestren la aprobación de HCP y que informen la cantidad de impurezas de HCP en el producto terminado. Aunque los métodos de detección de HCP están bien establecidos, muchos laboratorios luchan con el desarrollo y la calificación del ensayo. En particular, hay una serie de factores a considerar al seleccionar y validar un ELISA HCP, que es el ensayo caballo de batalla para la detección y el control de CHO-HCP.

A continuación, abordamos algunas de las preguntas más comunes y los principales desafíos de las pruebas de impurezas de CHO-HCP.

¿Qué son las proteínas de la célula huésped (HCP)?

Las HCP son proteínas endógenas al sistema de expresión del huésped o al sustrato celular que se utilizan para producir un producto farmacológico terapéutico. Muchas HCP son secretadas activamente por las células huésped en el medio de cultivo circundante. Otros pueden ser liberados durante el curso de la muerte celular o tras la lisis celular, por ejemplo, durante los procedimientos rutinarios de paso o recolección de células.

La mayoría de los HCP tienen una abundancia muy baja en relación con el producto terapéutico, y muchos son bastante fáciles de eliminar mediante pasos de purificación posteriores, como la cromatografía de afinidad y la exclusión por tamaño. Sin embargo, algunos HCP tienen el potencial de copurificarse con productos terapéuticos, lo que dificulta su eliminación y puede comprometer la calidad del producto o la seguridad clínica.

¿Cuáles son los riesgos de las impurezas HCP y cómo se regulan?

La inmunogenicidad de los HCP es una de las mayores preocupaciones para los desarrolladores y reguladores de fármacos debido a las implicaciones para la seguridad del paciente. El sistema inmunológico humano es exquisitamente sensible para detectar y montar una respuesta defensiva a cualquier proteína extraña que encuentre. Esto significa que, en las circunstancias adecuadas, prácticamente cualquier HCP de un huésped «no propio», como una línea de células CHO, podría desencadenar una respuesta inmunitaria potencialmente mortal o una sensibilidad persistente en los pacientes.

La actividad biológica de los HCP es otra preocupación importante. Muchos HCP copurificadores son enzimas que pueden degradar el producto terapéutico o los excipientes de la formulación, incluso cuando están presentes en niveles extremadamente bajos. Con el tiempo, esta actividad puede reducir la estabilidad, la eficacia o la potencia del fármaco en la formulación final. Algunos HCP tienen actividades biológicas que pueden mediar efectos toxicológicos en el objetivo o fuera del objetivo en los pacientes. Estos incluyen varias citocinas y quimiocinas, hormonas, moléculas reguladoras y enzimas. 1

Figura 1. ¿Qué son los CHO HCP?

¿Por qué la detección de HCP y el desarrollo de ensayos son tan desafiantes?

Las agencias reguladoras clasifican a los HCP como un atributo de calidad crítico (CQA) que debe ser monitoreado e informado. El desafío central en la detección y el seguimiento de HCP es que las poblaciones de HCP son muy heterogéneas y variables. Las muestras recolectadas en varios puntos durante el bioprocesamiento pueden contener cientos o incluso miles de especies de proteínas diferentes con propiedades fisicoquímicas muy diferentes. Con cada paso sucesivo de bioprocesamiento, el perfil de HCP cambia. Las opciones de tecnología y las variaciones en las condiciones de procesamiento también pueden alterar significativamente la cantidad total y los niveles relativos de especies de HCP individuales que se encuentran en cada etapa del proceso.

Por lo tanto, establecer un ensayo único con una cobertura lo suficientemente amplia para detectar la mayoría de las especies de HCP en cualquier muestra dada es una tarea difícil. Esto se complica aún más por la necesidad de una alta sensibilidad de detección (tan baja como unas pocas partes por millón) y un rango dinámico lo suficientemente amplio como para poder monitorear de manera precisa y confiable los niveles cambiantes de HCP de baja abundancia en un contexto de altos niveles de proteína terapéutica.

¿Qué tipo de ensayo es el más apropiado: genérico o específico del proceso?

Las pruebas de HCP juegan un papel crucial en el desarrollo, la validación y el control del proceso de fabricación biofarmacéutica. Es fundamental para demostrar la autorización HCP de los lotes de producción que se utilizarán para la validación del proceso y los estudios de toxicología preclínica, y se requiere para la liberación reglamentaria del material antes de los estudios clínicos y el uso comercial.

El inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA), en particular el ELISA sándwich, se ha convertido en la metodología de elección para cuantificar el HCP total en el desarrollo y la fabricación de bioprocesos. En esencia, los ELISA HCP se basan en reactivos de anticuerpos policlonales de alta calidad para proporcionar una amplia cobertura, sensibilidad y especificidad para poblaciones heterogéneas de HCP.

Según el uso del antígeno para la generación de anticuerpos policlonales, los HCP-ELISA pueden ser genéricos o específicos del proceso. La cuestión de qué tipo de ensayo usar cuando no siempre es clara. Los ensayos genéricos brindan la máxima flexibilidad durante las primeras etapas del desarrollo preclínico y clínico, cuando las poblaciones de HCP son muy variables. Esto se debe a que los anticuerpos anti-HCP están diseñados para reconocer un amplio espectro de HCP representativos de una variedad de diferentes procedimientos de proceso aguas arriba y cepas de expresión del huésped común.

Los ensayos genéricos de HCP se vuelven menos relevantes o apropiados durante las últimas etapas del desarrollo clínico, especialmente desde el inicio de los ensayos clínicos de fase III en adelante, cuando la sustancia farmacológica se debe producir con las mismas especificaciones que el producto comercial.

En este punto, generalmente se requiere un ensayo HCP más personalizado y específico del proceso para monitorear adecuadamente la población única de HCP asociada con el bioproceso aprobado. Sin embargo, los ensayos HCP genéricos a veces se pueden usar para el desarrollo de fase tardía, siempre que haya datos suficientes para demostrar que el ensayo cumple con los criterios de rendimiento y cobertura requeridos.

Criterios de rendimiento para inmunoensayos genéricos HCP

Para calificar para su uso en el desarrollo y la fabricación de bioprocesos, los inmunoensayos HCP deben estar bien caracterizados y satisfacer criterios de rendimiento estrictos. Desde un punto de vista regulatorio, algunos de los criterios más importantes a considerar durante la validación del ensayo incluyen:

Cobertura

Demostrar una cobertura suficiente para detectar el amplio espectro de especies HCP esperadas en varias muestras de bioprocesos es un requisito de validación clave. La capacidad de cobertura de los reactivos policlonales anti-HCP generalmente se evalúa mediante electroforesis bidimensional diferencial en transferencia (2D-DIBE) o cromatografía de afinidad HCP.

Las pautas regulatorias no establecen una especificación de cobertura mínima, sino que recomiendan que la cobertura sea lo más amplia posible dentro de los límites de la practicidad. Para los kits de inmunoensayo CHO-HCP comerciales genéricos, es razonable esperar una cobertura de al menos el 50 % (según la evaluación de 2D-DIBE) para las cepas de células CHO más utilizadas en la fabricación biofarmacéutica comercial (p. ej., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44), aunque se considera alcanzable una cobertura de hasta el 80 % con las tecnologías actuales.

Sensibilidad

Dado que incluso pequeñas cantidades de ciertos HCP pueden ser inmunogénicos o afectar la estabilidad del producto, es esencial una alta sensibilidad del ensayo. La capacidad de detectar de manera confiable concentraciones de HCP tan bajas como unos pocos nanogramos por ml es muy deseable para mitigar el riesgo. La sensibilidad del ensayo normalmente se expresa en términos del límite inferior de detección (LOD). El límite de cuantificación (LOQ) también es un criterio útil, ya que indica la concentración más baja que se puede medir con una precisión y exactitud aceptables.

Efectos de matriz

Al analizar muestras biológicas complejas, como el sobrenadante de cultivo crudo, es importante demostrar que no hay sustancias en la muestra que puedan interferir (deprimir o mejorar) la señal del ensayo para sesgar los resultados. El potencial de estos efectos de matriz se evalúa ejecutando el ensayo en muestras simuladas que se han enriquecido con una cantidad conocida de analito HCP. La concentración de analito medida por el ensayo se expresa luego como un porcentaje de la concentración esperada. Los valores de recuperación de antígeno en el rango de 80 a 120% generalmente se consideran aceptables.

Linealidad y rango dinámico 

Una buena linealidad de dilución en una amplia gama de concentraciones de proteínas es crucial para garantizar una exactitud y precisión aceptables en las mediciones de HCP. Las evaluaciones multipunto de linealidad de dilución y aumento y recuperación generalmente se realizan en un rango de concentración esperado de 0-200 ng/mL.

Figura 2. Criterios de rendimiento para inmunoensayos genéricos HCP

Mejorar y acelerar las pruebas de CHO-HCP

En los últimos años, se ha logrado un progreso significativo en las tecnologías de inmunoensayo HCP. En particular, se han realizado una serie de avances para mejorar la sensibilidad de las tecnologías de inmunoensayo, eliminar la necesidad de pasos de lavado y optimizar los flujos de trabajo de los ensayos para una automatización más sencilla y un mayor rendimiento.

El sándwich ELISA (Figura 1) es uno de los formatos de inmunoensayo más utilizados para la cuantificación de HCP. Al intercalar el antígeno entre dos anticuerpos específicos de HCP, este formato generalmente logra una mayor especificidad y sensibilidad que los ELISA directos convencionales. Además, no es necesario purificar el antígeno antes de la medición, lo que convierte a este tipo de ensayo en una buena opción cuando se analizan muestras HCP complejas, como sobrenadantes de cultivos celulares o extractos celulares crudos.

Figura 3. Principio ELISA sándwich

Una preocupación con los ensayos ELISA en las pruebas HCP es la necesidad de múltiples adiciones de reactivos y pasos de lavado que contribuyen a la variabilidad del ensayo y complican la automatización. Los ensayos HTRF (Figura 2) ofrecen una alternativa sin lavado que combina la tecnología FRET estándar con mediciones de fluorescencia resueltas en el tiempo. La tecnología permite un formato de ensayo simplificado de «mezclar y leer» que es más robusto, sensible y más fácil de automatizar que los ELISA convencionales. Estos beneficios hacen de HTRF una opción popular para aplicaciones de alto rendimiento.

Figura 4. Principio de ensayo HTRF.

Otro enfoque de ensayo que supera muchas limitaciones de los inmunoensayos estándar es AlphaLISA® (Figura 3). Al igual que HTRF, AlphaLISA es una tecnología de proximidad basada en perlas que elimina la necesidad de pasos de lavado. Lo que distingue a este enfoque de otros enfoques de inmunoensayo es el uso de la química de canalización de oxígeno luminiscente. Esto proporciona una amplificación de señal superior en comparación con la amplificación enzimática convencional. La interferencia de fondo también se reduce en gran medida porque la longitud de onda de la luz emitida es más corta que la longitud de onda de excitación.

 

Figura 5. Principio del ensayo AlphaLISA. 

Consigue tu Guía y Nota de Aplicación

Si desea obtener más información sobre las últimas herramientas y estrategias para la detección de HCP, descargue nuestra nueva guía integral, «Detección de proteínas de células huésped CHO en el desarrollo y la fabricación biofarmacéuticos».

Para obtener una demostración detallada de cómo los kits de ensayo HTRF y AlphaLISA CHO-HCP pueden aumentar tanto la eficacia como la eficiencia cuando se incorporan a sus flujos de trabajo existentes, lea nuestra nota de aplicación relacionada, «Agilice el flujo de trabajo de cuantificación de impurezas de CHO HCP con el nuevo HTRF de alto rendimiento y sin lavado». ® y AlphaLISA® CHO Kits de proteínas de células huésped”.

 

Nota:

  1. https://www.biophorum.com/host%20cell%20proteins/ ofrece la información más reciente sobre este tema, incluida una lista completa de CHO HCP potencialmente problemáticos y de alto riesgo.
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