Vaya con la corriente: Ensayos de citometría de flujo para la detección de muerte celular

La detección de muerte celular es una de las aplicaciones de citometría de flujo más reconocidas. En combinación con varios tintes de detección de muerte, la citometría de flujo se puede utilizar para determinar si las células están experimentando procesos de muerte. Aunque ya es informativo saber si una célula está muriendo o ha estado muerta, también podría ser valioso revelar detalles sobre los procesos de muerte celular. Como primera parte de esta serie, repasamos las vías, la terminología y los mecanismos de muerte celular para familiarizarnos con los marcadores utilizados en la citometría de flujo.

Detrás de la alternancia morfológica de las células moribundas, hay muchos más detalles en términos de marcadores y vías, y algunos de ellos pueden detectarse mediante citometría de flujo. Por ejemplo, observe el siguiente diagrama para ver la alternancia morfológica típica que ocurre en varios tipos de muerte celular. La alteración morfológica se centra en el tamaño celular, la integridad de la membrana, la densidad de la cromatina, la disposición de los orgánulos y la presencia de vacuolas.

 

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Figura 1. Morfología típica de cada muerte celular 1 .

Es importante señalar que hay muchos más detalles detrás de la alternancia morfológica de las células moribundas. Tenga en cuenta que hay diez modalidades de muerte celular (apoptosis, autofagia, entosis, metuosis, paraptosis, mitoptosis, parthanatos, ferroptosis, piroptosis y necroptosis) y algunos de los marcadores y vías que ve en este diagrama a continuación (consulte la figura 2) se puede detectar mediante citometría de flujo.

 

 

 

 

 

 

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Figura 2. Sinopsis de los procesos de muerte celular 1 .

Es esencial tener en cuenta que muchos ensayos, como el ensayo de permeabilidad de membrana con PI o 7AAD, y el ensayo de asimetría de membrana con anexina V, se utilizan para detectar alteraciones morfológicas de las células, mientras que muchas alteraciones morfológicas son comunes para varios procesos de muerte celular. definido originalmente con vías moleculares. Por lo tanto, puede esperar ver el ensayo de permeabilidad o el ensayo de asimetría aparecer una y otra vez en la detección de varios procesos de muerte celular; se realizan para confirmar vías de muerte celular ya conocidas, pero no para determinar el tipo de muerte celular. Por otro lado, también presentamos los marcadores altamente específicos de varios tipos de muerte celular en esta serie, incluida Caspasa-3 de apoptosis, LC3-II de autofagia, transferrina de ferroptosis, etc.

Siempre hay espacio para agregar tinción viva/muerta a su panel de citometría de flujo.

Los especialistas del servicio científico recomiendan agregar tinción viva/muerta encima de cada panel de citometría de flujo. Las células muertas, generalmente con una estructura de membrana compuesta, son «pegajosas» debido a la exposición del contenido de ácido nucleico, lo que lleva a una unión no específica de anticuerpos, un índice de tinción relativamente más bajo e incluso lecturas falsas positivas. Por eso es óptimo incluir tinción vivo/muerto.

Naturalmente, la adición de dicha tinción viva/muerta aumenta la complejidad del diseño del panel además de los números de parámetros ya florecientes de los paneles de citometría de flujo. Sin embargo, el número de canales de rápido crecimiento de los citómetros de flujo recientemente anunciados y la introducción de la citometría de flujo espectral permiten muchas opciones de tinción viva/muerta para aliviar el estrés en el diseño del panel. Además, los fabricantes de reactivos han respondido bien a la necesidad de opciones de color de tinción viva/muerta con numerosos productos. No podemos enfatizar esto lo suficiente: siempre hay espacio para agregar tinción viva/muerta a su panel de citometría de flujo.

A pesar de la enorme cantidad de tinción viva/muerta, no hay una diferencia significativa en sus mecanismos básicos de trabajo. Las células vivas suelen estar intactas y mantienen la integridad de su membrana, por lo que pueden excluir colorantes para teñir aminas libres en el citoplasma o ácidos nucleicos; por el contrario, la membrana compuesta por células muertas es permeable a esos colorantes, lo que permite la unión de sondas fluorescentes a células muertas. Por lo tanto, se denomina exclusión de células muertas. Tenga en cuenta que los tintes de unión a ácidos nucleicos SOLO se pueden usar para discriminar células vivas/muertas en suspensión de células frescas, ya que esos tintes pueden liberarse de células muertas previamente existentes durante la fijación y la permeabilización y unirse a otras células. Los colorantes reactivos con amina son fijables,

La siguiente tabla resume los productos de tinción vivos/muertos más populares.

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Como puede ver en la tabla anterior, hemos identificado nombres comerciales o genéricos, proveedores y otras especificaciones técnicas. Su láser de excitación (color), los picos de excitación y emisión y los nombres de los canales de mejor coincidencia están codificados por colores. Tenga en cuenta que la gran mayoría de los canales de fluorescencia en los citómetros de uso común reciben el nombre de los colorantes conjugados de los anticuerpos, pero no de los colorantes vivos/muertos. Por lo tanto, solo podemos describir aquellos canales que son los que «mejor coinciden» con la tinción viva/muerta enumerada.

Algunos tintes de ácido nucleico, como Hoechst y DRAQ5 que se enumeran arriba, pueden penetrar la membrana celular intacta a niveles de concentración altos. Por lo tanto, la concentración final se optimizará cuando se elijan para el ensayo de exclusión de células muertas.

Esperamos que la primera parte de esta serie le brinde una comprensión más profunda de los mecanismos de muerte celular para que esté más familiarizado con los marcadores utilizados en la citometría de flujo.


1 Yan, G., Elbadawi, M., Efferth, T.” Múltiples modalidades de muerte celular y sus características clave (Revisión)”. Revista de la Academia Mundial de Ciencias 2, no. 2 (2020): 39-48. https://doi.org/10.3892/wasj.2020.40

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